Trucos del proceso para diluir anticuerpos

La unión de los antígenos a los anticuerpos depende del pH y está muy controlada por interacciones iónicas. Los diluyentes con un pH relativamente neutro (pH de 7,0 a 7,4) suelen ser amortiguadores ideales y un excelente punto de partida para la optimización. "El punto isoeléctrico, o pI (el pH en el que la carga eléctrica neta de una molécula es cero), para las inmunoglobulinas puede oscilar entre 5,8 y 8,5 para un anticuerpo dado". (1)

Si el pH del diluyente está demasiado cerca del pI del anticuerpo, la solubilidad puede debilitarse, dando como resultado efectos negativos sobre la tinción y el fondo. Las cadenas laterales de aminoácidos en anticuerpos y antígenos también se ven afectadas por el pH. Por ejemplo, a pH 6,0, la mayoría de los aminoácidos histidinas están cargados positivamente y son atraídos por cargas negativas en el antígeno, pero a un pH de 7,9, los aminoácidos histidinas están en su mayoría sin carga y son repelidos por las cargas negativas del antígeno. Por lo tanto, se debe elegir un diluyente de anticuerpos para que sea compatible con las fuerzas de atracción predominantes para el anticuerpo y antígeno particulares. Además, los aditivos diluyentes habituales, como sales y azidas, que se utilizan para "reducir las interacciones no específicas entre moléculas cargadas" (1), pueden afectar la fuerza iónica y alterar la interacción de los anticuerpos. Una fuerza iónica excesiva puede provocar una disminución de la reactividad de la unión anticuerpo-antígeno.

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No asuma que todos los diluyentes de anticuerpos son iguales

Pruebe el anticuerpo concentrado con diferentes diluyentes (variando el pH y la composición) si el fabricante del anticuerpo no recomienda alguno.

No altere significativamente el pH del diluyente al optimizar

Sube y baja el pH en 0,5 unidades de pH si se observa una señal baja o un fondo alto.

No use diluyentes que contengan suero si no es necesario; el suero puede unirse al anticuerpo primario causando una disminución de la sensibilidad o incluso resultados falsos positivos si se une al anticuerpo secundario.

Tenga cuidado si no se dispone de una opción sin suero; tal vez pruebe con un bloqueador de proteína endógeno separado del diluyente.

No cambie con frecuencia o rápidamente la temperatura del diluyente/solución de trabajo, ya que la refrigeración y el calentamiento pueden cambiar el pH de amortiguadores sensibles a la temperatura (especialmente amortiguadores basados en Tris). (1)

Deje que la solución de diluyente / anticuerpo de trabajo alcance la temperatura ambiente antes de usarla. Las soluciones deben prepararse a la temperatura a la que se utilizarán.

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Biocare Medical ofrece una línea completa de diluyentes de anticuerpos que están especialmente formulados para mejorar la titulación de anticuerpos y son extremadamente estables para el almacenamiento de anticuerpos a largo plazo. En la mayoría de los casos, cuando se comparan con otros diluyentes basados en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y basados en Tris, la titulación de anticuerpos pueden mejorarse de 2 a 4 veces. Las diluciones de anticuerpos primarios mayores pueden proporcionar ahorros de costos, mayor especificidad y reducir la tinción de fondo no específica. Los diluyentes de Biocare están listos para usar y no contienen proteasas ni IgG. Para mayor comodidad, todos los anticuerpos primarios de Biocare Medical se prueban con todos los diluyentes de Biocare y se recomienda el diluyente que produce resultados óptimos en la hoja de técnica.

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CD117 diluido en un diluyente estándar de PBS, 1: 800 (izquierda) frente a CD117 diluido en Renoir Red de Biocare, 1: 800 (derecha)

CD117, 1: 800, diluyente a base de Tris, pH 6,0

ER, 1: 200, diluyente PBS, pH 6,0

CD117, 1: 800, diluyente PBS, pH 7,4

ER, 1: 100, diluyente PBS, pH 7,4

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Oferta de diluyentes de anticuerpos de Biocare Medical